Densitometría con ImageJ

Voy a explicar una manera muy sencilla de determinar la intensidad de las bandas de un western blot o de cualquier otro tipo de gel.  Aunque se podria utilizar el software del Chemidoc (QuantityOne) que esta espeficicamente pensado para este tipo de cosas, he utilizado el ImageJ porque creo que es mas sencillo hacer la densitometria con el y segundo porque es un programa gratuito de procesado de imagenes cientificas de lo mas potente que conozco que esta a disposicion de todo el mundo y que entre todos podemos ir aprendiendo a utilizar.

 

WB a cuantificar. 4 calles, 2 bandas por calle. Bastante limpio.

Para determinar las intensidad de las bandas de este western blot lo primero fue utilizar el Chemidoc de Biorad para adquirir una imagen digital. Hay que tener cuidado no pasarse con la exposición y evitar que hay zonas saturadas. Para esto es muy util visualizar en histograma de la imagen durante la aquisicion. Imagino que también podría escanearse una pelicula fotográfica, pero en ese caso resulta complicado saber si la pelicula esta sobreexpuesta.

A continuación se exporta la imagen del Chemidoc como un archivo TIFF y se habre con ImageJ. Alli se puede ajustar los niveles de la imagen para verla mejor, pero sin aplicar las modificaciones para que no afecten a la cuantificación y se procede de la siguiente manera:

1) Seleccionar un rectangulo lo mas ajustado posible a la primera calle.

2) >Analyze/Gels/Select First Lane

3) Mover el rectangulo a la senguda calle >Analyze/Gels/ Select Next Lane. Repetir con todas las calles.

4) >Analyze/Gels/Plot Lanes para generar los perfiles de cada calle.

5) Delimitar los límites de cada banda mediante líneas rectas. Esto puede ser un poco subjetivo, pero si las bandas estan bien definidas las diferencias son minimas.

6) Ir seleccionando una a una y por orden cada una de las bandas con la varita magica.

7) Por ultimo >Analyze/Gels/Label Peaks. El area de cada banda y el porcentaje que representa respecto al area total de todas las bandas seleccionadas aparece en pantalla. Tambien se puede utilizar >Analyze/Gels/Draw Lanes Outline para generar una nueva imagen que incorpore los límites que hemos seleccionado para cada calle.

Perfiles de cada calle con el area de cada pico proporcional a la intesidad de cada banda. Los valores tambien se muestran en una tabla.